本篇樣本處理方法旨在作為一般參考，具體方案因樣本類型而異，需要您根據(jù)參考文獻并自行驗證決定，從而選擇更適合自己樣本的處理方案。
常見樣本
1. 血清
將血液樣本收集于無抗凝劑的試管或離心管中，于室溫靜置30 min以上（具體時間視室溫環(huán)境決定）或4℃過夜靜置至自然凝固，令血清析出。4℃，1000×g離心15-20 min，收集并分裝上清液，根據(jù)需要取適量上清液用于ELISA測定，其余樣品-20℃或-80℃儲存?zhèn)溆茫⒈M量減少凍融循環(huán)。
注意事項：
（1） 血液樣本采集過程中應(yīng)避免溶血，采集得到的血清樣本應(yīng)該是淡黃色透明或半透明液體，如果樣本呈紅色，說明采集過程中出現(xiàn)了溶血現(xiàn)象。紅細胞溶解時會釋放出具有過氧化物酶活性的物質(zhì)，以HRP為標(biāo)記的ELISA測定中，溶血標(biāo)本可能會增加非特異性顯色。
（2） 避免使用高血脂樣本。脂質(zhì)會影響抗原抗體的結(jié)合，從而影響測值的準(zhǔn)確性。
（3） 應(yīng)避免細菌污染，因為細菌分泌的酶可能對蛋白產(chǎn)生分解作用，且菌體內(nèi)可能含有內(nèi)源性的HRP從而導(dǎo)致檢測的假陽性。
（4） 血清樣本宜在新鮮時檢測；保存過程中如有沉淀生成，應(yīng)再次離心；樣本使用前應(yīng)緩慢均衡至室溫，不應(yīng)加熱使之融解。
2. 血漿
將血液樣本收集于含有抗凝劑的試管或離心管中，在采集的30 min內(nèi)4℃，1000×g離心15-20 min，立即收集并分裝上清液，根據(jù)需要取適量上清液用于ELISA測定，其余樣品-20℃或-80℃儲存?zhèn)溆?，并盡量減少凍融循環(huán)。
注意事項：
（1） 常用的抗凝劑包括EDTA、枸櫞酸鈉等。樣品處理前請仔細閱讀ELISA試劑盒說明書，查看選用的試劑盒針對抗凝劑是否有特殊要求。
附表：ELISA樣品處理常見抗凝劑特性總結(jié) | |
名稱 | 抗凝原理與特點 |
EDTA | 目前使用最多和應(yīng)用最廣泛的抗凝劑。 通過與血液中鈣離子結(jié)合成螯合物，阻止血液凝固。對血細胞形態(tài)、血小板計數(shù)影響小，穩(wěn)定性高。 |
枸櫞酸鹽（鈉鹽） | 與血液中鈣離子結(jié)合成螯合物，阻止血液凝固。 對凝血因子有很好的保護作用，適用面廣。血液中溶解度低，抗凝作用較弱。 |
肝素鹽（鋰，鈉，鉀鹽） | 通過加強抗凝血酶Ⅲ（AT-Ⅲ）滅活絲氨酸蛋白酶，阻止凝血酶的形成，并阻止血小板聚集，從而阻止血液凝固。肝素是紅細胞透滲脆性試驗的理想抗凝劑。但不適于CBC、細胞形態(tài)學(xué)檢查。 優(yōu)點抗凝能力強、不影響血細胞體積、不易溶血、能耐高溫。缺點是成本高、會引起白細胞聚集。肝素抗凝血應(yīng)于短時間內(nèi)使用，否則放置過久血液又可凝固。 |
對于欣博盛ELISA試劑盒，建議避免使用肝素鹽作為抗凝劑。
（2） 血液樣本采集過程中應(yīng)避免溶血。
（3） 避免使用高血脂樣本。脂質(zhì)會影響抗原抗體的結(jié)合，從而影響測值的準(zhǔn)確性。
（4） 保存過程中如有沉淀生成，應(yīng)再次離心；樣本使用前應(yīng)緩慢均衡至室溫，不應(yīng)加熱使之融解。
3. 細胞培養(yǎng)上清
如果目的物是分泌型，即可選擇細胞培養(yǎng)上清作為樣本。
將細胞培養(yǎng)上清液收集于干凈的無菌試管中，4℃，1000×g離心15-20 min，除去細胞碎片和雜質(zhì)，收集并分裝上清液，根據(jù)需要取適量上清液用于ELISA測定，其余樣品-20℃或-80℃儲存?zhèn)溆?，并盡量減少凍融循環(huán)。
注意事項：
（1）細胞培養(yǎng)上清樣本成分復(fù)雜，若檢測上清液中特定蛋白時，血清中的成分會對ELISA檢測結(jié)果造成影響。在收集上清前24小時，應(yīng)改用不完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。
（2）細胞樣本干擾因素較多， 如細胞狀態(tài)、細胞數(shù)量、酸堿度、培養(yǎng)基鹽離子濃度、采樣時間等，在樣本準(zhǔn)備過程中應(yīng)盡量使鋪板時接種細胞數(shù)量水平一致、生產(chǎn)狀態(tài)相當(dāng)。
（3）保存過程中如有沉淀生成，應(yīng)再次離心；樣本使用前應(yīng)緩慢均衡至室溫，不應(yīng)加熱使之融解。
（4）收集細胞培養(yǎng)上清前建議做支原體檢測，避免支原體污染。
4.細胞裂解液
如果目的物主要存在于胞內(nèi)，建議選擇細胞裂解液作為樣本類型。實驗中選擇裂解液作為空白對照。
對于貼壁細胞，吸去培養(yǎng)基，用胰蛋白酶消化細胞，再加入適量的培養(yǎng)基，將細胞沖洗干凈（若為懸浮細胞，可省略該步驟），將細胞懸浮液收集于離心管中，1000×g離心5 min收集細胞，用預(yù)冷PBS（0.01 mol/L，pH 7.0-7.4）洗滌3次，再加入適量預(yù)冷PBS重懸細胞。
物理裂解法：通過超聲破碎或反復(fù)凍融使細胞破裂，釋放內(nèi)容物；
化學(xué)裂解法：通過化學(xué)提取液和洗滌劑裂解細胞，如RIPA、TritonX-100、NP-40和SDS、脫氧膽酸鈉、β巰基乙醇、DTT等，使細胞破裂，釋放內(nèi)容物。
將裂解好的細胞在4℃，1000×g條件下離心15-20 min，除去細胞碎片和雜質(zhì)，收集并分裝上清液，根據(jù)需要取適量上清液用于ELISA測定，其余樣品-20℃或-80℃儲存?zhèn)溆?，并盡量減少凍融循環(huán)。
注意事項：
（1）細胞樣本干擾因素較多， 如細胞狀態(tài)、細胞數(shù)量、酸堿度、培養(yǎng)基鹽離子濃度、采樣時間等，在樣本準(zhǔn)備過程中應(yīng)盡量使鋪板時接種細胞數(shù)量水平一致、生產(chǎn)狀態(tài)相當(dāng)。
（2）破碎細胞的同時會釋放蛋白酶，故需在細胞破碎前加入蛋白酶抑制劑（如PMSF蛋白酶抑制劑）以防止蛋白質(zhì)水解。
（3）一般情況下物理裂解法優(yōu)于化學(xué)裂解法，化學(xué)裂解過程中引入酸或堿，可能對ELISA檢測結(jié)果造成影響；若化學(xué)裂解法中的去污劑成分會干擾抗原抗體反應(yīng)影響ELISA檢測效果，需要除去去污劑成分。
（4）保存過程中如有沉淀生成，應(yīng)再次離心；樣本使用前應(yīng)緩慢均衡至室溫，不應(yīng)加熱使之融解。
（5）收集細胞培養(yǎng)上清前建議做支原體檢測，避免支原體污染 。
5. 組織勻漿液
組織樣本通常制成組織勻漿，下面是常見的ELISA組織樣本處理方法的整理。
使用干凈的工具解剖目標(biāo)組織并盡快置于冰上，以防被蛋白酶降解；取適量的組織塊（組織較大需剪碎）于預(yù)冷的PBS（0.01 mol/L，pH 7.0-7.4）中清洗去表面殘留的血液與冗余組織，稱重備用。
加入適量的預(yù)冷PBS（PBS的體積取決于組織的重量，5-9 mL PBS適用于1 g組織，建議使用前立即在PBS中加入適量蛋白酶抑制劑），用玻璃勻漿器充分研磨勻漿，有條件的實驗室可以使用機器勻漿或超聲粉碎。也可采用反復(fù)凍融的方式獲取組織勻漿液，但次數(shù)不可過多，部分酶活力會受影響。
將勻漿液收集于干凈的離心管中，4℃，5000×g離心5-10 min，置于冰上，收集并分裝上清液，根據(jù)需要取適量上清液用于ELISA測定，其余樣品-20℃或-80℃儲存?zhèn)溆?，并盡量減少凍融循環(huán)。
注意事項：
（1） 全程需在冰上進行。
（2） 如樣品需要長期保存，應(yīng)添加蛋白酶抑制劑。
（3） 根據(jù)實驗需要，建議組織勻漿液先定量總量總蛋白。ELISA檢測指標(biāo)眾多，組織樣本如肝組織、腎組織、腦組織等含有的蛋白復(fù)雜，可能會導(dǎo)致檢測的假陽性，需要對高濃度的樣本進行稀釋，判斷是否存在假陽性的可能；組織塊的大小區(qū)別、提取蛋白的效率區(qū)別會導(dǎo)致樣本間的蛋白含量存在差異，造成后續(xù)數(shù)據(jù)處理的困難，事先定量蛋白以便于統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)。
（4） 保存過程中如有沉淀生成，應(yīng)再次離心；樣本使用前應(yīng)緩慢均衡至室溫，不應(yīng)加熱使之融解。
其他樣本
總的來說，因為ELISA只能檢測可溶性蛋白的含量，所以樣本處理的原則是保證所有樣本均為澄清的液體，沉淀或懸浮物都應(yīng)去除。保存過程中如有沉淀生成，應(yīng)再次離心；樣本使用前應(yīng)緩慢均衡至室溫，不應(yīng)加熱使之融解。樣本處理與保存過程中須保證樣本不含NaN3，因為NaN3會抑制HRP的活性，從而導(dǎo)致假陰性的結(jié)果。
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1.唾液
在唾液樣本采集之前，建議受試者不要吃東西、抽煙或喝飲料。用生理鹽水徹底漱口后，采集唾液于無菌管中。立即4℃，1000×g條件下離心15-20 min，收集并分裝上清液，根據(jù)需要取適量上清液用于ELISA測定，其余樣品-20℃或-80℃儲存?zhèn)溆?，并盡量減少凍融循環(huán)。
2.痰液
選擇痰液中較為粘稠部分稱重，加兩倍體積于痰量的 0.1% DTT以溶解粘液，用吸管反復(fù)吹打，漩渦器振蕩15 s，37℃恒溫水浴振蕩5 min；加入兩倍體積于痰量的PBS緩沖液（0.01 mol/L，pH 7.0-7.4）繼續(xù)振蕩15-20 min，用金屬網(wǎng)或濾紙過濾，4℃，1000×g條件下離心15-20 min，收集并分裝上清液，根據(jù)需要取適量上清液用于ELISA測定，其余樣品-20℃或-80℃儲存?zhèn)溆?，并盡量減少凍融循環(huán)。
3.尿液
將尿液收集于無菌管中。4℃，1000×g條件下離心15-20 min，收集并分裝上清液，根據(jù)需要取適量上清液用于ELISA測定，其余樣品-20℃或-80℃儲存?zhèn)溆茫⒈M量減少凍融循環(huán)。
4.糞便
盡量采集干的糞便，糞便過稀會較難處理且降低檢測的準(zhǔn)確性。采集的重量應(yīng)大于50mg，糞便加入預(yù)冷PBS振蕩（0.01 mol/L，pH 7.0-7.4，PBS的體積取決于組織的重量，5-9 mL PBS適用于1 g組織），將糞便充分研磨勻漿，有條件的實驗室可以使用機器勻漿或超聲粉碎，4℃，1000×g條件下離心15-20 min，收集并分裝上清液，根據(jù)需要取適量上清液用于ELISA測定，其余樣品-20℃或-80℃儲存?zhèn)溆茫⒈M量減少凍融循環(huán)。
5.腦脊液
將腦脊液樣本收集于無菌管中，注意采集時避免血液污染；4℃，1000×g條件下離心15-20 min，收集并分裝上清液，根據(jù)需要取適量上清液用于ELISA測定，其余樣品-20℃或-80℃儲存?zhèn)溆?，并盡量減少凍融循環(huán)。
6.肺泡灌洗液
按常規(guī)方法進行支氣管肺泡灌洗，回收肺泡灌洗液于無菌管中，4℃，1000×g條件下離心15-20 min，收集并分裝上清液，根據(jù)需要取適量上清液用于ELISA測定，其余樣品-20℃或-80℃儲存?zhèn)溆?，并盡量減少凍融循環(huán)。
7.胸腹水
按常規(guī)方法進行胸腔穿刺取胸腔積液，收集胸腹水于無菌管中，4℃，1000×g條件下離心15-20 min，收集并分裝上清液，根據(jù)需要取適量上清液用于ELISA測定，其余樣品-20℃或-80℃儲存?zhèn)溆茫⒈M量減少凍融循環(huán)。
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