眾所周知，我們目前常用的ELISA試劑盒，可分為四種類型，分別是雙抗夾心法/直接法/間接法和競(jìng)爭(zhēng)法。今天小欣就來(lái)帶大家了解這四種ELISA試劑盒的一種，雙抗夾心法。
雙抗體夾心法的基本原理是：將定量的包被抗體以物理吸附的方法固定于微孔板表面，然后加入待檢標(biāo)本，通過(guò)加入檢測(cè)抗體，酶標(biāo)記第二抗體后用TMB底物顯色，微孔板中顏色的深淺與待測(cè)物的濃度呈正相關(guān)。
雙抗夾心法ELISA的試劑盒組成通常包含以下幾類組分：
1 包被抗體
許多物質(zhì)可作為固相載體，如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纖維素等，在進(jìn)行抗體固定化之前，需要對(duì)酶標(biāo)板材進(jìn)行篩選。酶標(biāo)板由親水到疏水，對(duì)蛋白的結(jié)合會(huì)由強(qiáng)變?nèi)?，造成吸附能力的差異。將抗體吸附在固相載體表面時(shí)，要求純度要好，吸附時(shí)一般要求pH在9.0～9.6之間。蛋白質(zhì)包被的最適濃度需進(jìn)行滴定：用不同的蛋白質(zhì)濃度包被后，在其它試驗(yàn)條件相同時(shí)，觀察陽(yáng)性標(biāo)本OD值，選擇OD值最大而蛋白量最少的濃度。
2 標(biāo)準(zhǔn)品及樣本
標(biāo)準(zhǔn)品即為目標(biāo)物（樣本中待檢測(cè)因子）的純蛋白，從母液稀釋到級(jí)聯(lián)稀釋都需要特別留意，標(biāo)曲的制作是ELISA實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵。待檢目標(biāo)物需具備多個(gè)抗原表位，即二價(jià)或二價(jià)以上的大分子抗原，因?yàn)檫@種檢測(cè)方法需要兩種抗體。另外，需要注意的是血清樣本中的類風(fēng)濕因子（RF）干擾——RF能與多種動(dòng)物的變性IgG的Fc部分結(jié)合而產(chǎn)生假陽(yáng)性反應(yīng)。
3 洗滌液
ELISA操作中會(huì)涉及到多次洗板。長(zhǎng)時(shí)間的孵育后，會(huì)出現(xiàn)非特異性結(jié)合，這時(shí)就需要洗滌液來(lái)洗去非特異性結(jié)合的蛋白或抗體，通常為PBS，洗4-6次，每次30s左右。多次短時(shí)間洗板比少次長(zhǎng)時(shí)間洗板更有效，在最后一次洗板時(shí)，盡量拍凈液體，同時(shí)注意讓板子保持濕潤(rùn)。
4 檢測(cè)抗體
雙抗體夾心法中的檢測(cè)抗體與目標(biāo)蛋白結(jié)合位點(diǎn)需要有別于目標(biāo)物與包被抗體結(jié)合的位點(diǎn)，即會(huì)涉及抗體配對(duì)的問(wèn)題。常用的抗體配對(duì)方法有下幾種：
包被抗體為單抗，檢測(cè)抗體為多抗；
包被抗體為單抗，檢測(cè)抗體為單抗，但這兩種單抗針對(duì)的抗原表位不同；
包被抗體為多抗，檢測(cè)抗體為多抗，這兩種多抗一般來(lái)源于不同的宿主。
5 生物素標(biāo)記的二抗
鑒于酶標(biāo)二抗的局限性，現(xiàn)在廠家一般引入生物素親和素系統(tǒng)(biotin avidin system, BAS)，這種系統(tǒng)在提高反應(yīng)靈敏度的同時(shí)，應(yīng)用起來(lái)也更加方便。進(jìn)行生物素標(biāo)記時(shí)，可依據(jù)抗體所帶可標(biāo)記基團(tuán)種類（氨基、醛基、巰基等）以及分子酸堿性選擇相應(yīng)的活化生物素和反應(yīng)條件。生物素標(biāo)記后，不影響被標(biāo)記物的生物活性。
6 辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的親和素
每個(gè)親和素分子可與4個(gè)生物素分子結(jié)合，所以可以偶合更多連接生物素的酶分子，從而大大提高了ELISA實(shí)驗(yàn)的靈敏度。生物素和親和素間的親和力強(qiáng)，二者一旦結(jié)合，就極為穩(wěn)定，而且這種結(jié)合反應(yīng)時(shí)間比抗原抗體反應(yīng)所需時(shí)間短。在BAS檢測(cè)中多用鏈霉親和素“streptavidin, SA”，它是鏈霉菌培養(yǎng)過(guò)程中的分泌物，由4條相同的肽鏈組成。HRP靈敏，穩(wěn)定，比活性高，分子量小，純酶容易制備。其有4對(duì)半胱氨酸形成的二硫鍵，99位Asp和123位Arg形成的鹽橋，9個(gè)潛在的糖基化位點(diǎn)，有兩個(gè)金屬中心，可催化顯色底物TMB產(chǎn)生藍(lán)色一價(jià)物。
7 顯色底物
由于 TMB（3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺）比其他顯色底物具有更高的靈敏度且無(wú)致癌性、故而被廣泛使用。HRP 或其他適當(dāng)過(guò)氧化物酶能在過(guò)氧化氫存在下催化TMB生成可溶的藍(lán)色物，此時(shí)通?？稍?370nm 測(cè)定吸光度。當(dāng)顯色反應(yīng)被酸性溶液終止后，產(chǎn)物由藍(lán)色一價(jià)物轉(zhuǎn)為黃色二價(jià)物，此時(shí)可在 450nm 測(cè)定吸光度。
