QuantiCyto?ELISA基于雙抗體夾心法開發(fā)，利用兩種抗體（捕獲抗體和檢測(cè)抗體）協(xié)同測(cè)定樣本中抗原的含量。
以下提供QuantiCyto?ELISA試劑盒的完整使用方案。
實(shí)驗(yàn)材料準(zhǔn)備
實(shí)驗(yàn)所需材料
欣博盛生物所提供的所有QuantiCyto?ELISA試劑盒中包含完成整個(gè)實(shí)驗(yàn)所需的試劑，方便您的實(shí)驗(yàn)所需。
自備實(shí)驗(yàn)器材與耗材
1. 酶標(biāo)儀(450 nm波長(zhǎng)濾光片)
2. 進(jìn)口品牌高精度加液器及一次性吸頭：0.5-10 ul, 2-20 ul, 20-200 ul, 200-1000 ul。
3. 37 °C恒溫箱, 雙蒸水或去離子水，吸水紙等。
標(biāo)本收集
作為ELISA實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備步驟的重要環(huán)節(jié)之一，樣本收集與處理的好壞，可能直接影響實(shí)驗(yàn)的成功率與數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。
可用于ELISA實(shí)驗(yàn)的樣本一般為血清、血漿、細(xì)胞培養(yǎng)上清以及細(xì)胞裂解液、組織勻漿等，不同樣本有針對(duì)性的預(yù)處理方法。由于ELISA實(shí)驗(yàn)只能檢測(cè)可溶性蛋白質(zhì)的含量，因此樣本處理的原則為清晰透明并離心除去沉淀物或懸浮物質(zhì)。適當(dāng)?shù)臉颖绢A(yù)處理是確保ELISA實(shí)驗(yàn)正確性和準(zhǔn)確性的第一步。
關(guān)于標(biāo)本收集過程的詳細(xì)建議，請(qǐng)查看我們的站內(nèi)文章“ELISA樣本處理”或查看來自各大高校、研究所的科研人員的實(shí)驗(yàn)建議。
檢測(cè)前準(zhǔn)備工作
試劑盒平衡
提前20分鐘從冰箱中取出試劑盒，平衡至室溫。
標(biāo)準(zhǔn)品處理
開蓋前1000rpm離心1min。按說明書推薦體積加入標(biāo)準(zhǔn)品&標(biāo)本通用稀釋液至凍干標(biāo)準(zhǔn)品中，靜置15分鐘，待其充分溶解后，輕輕混勻。根據(jù)說明書推薦標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行稀釋。
其他工作液組分制備
洗滌液：實(shí)驗(yàn)開始前，用雙蒸水將濃縮洗滌液稀釋為1×工作液。未用完的放回4 °C
生物素化抗體工作液：按當(dāng)次檢測(cè)所需用量，于使用前20分鐘，用生物素化抗體稀釋液將濃縮生物素化抗體稀釋成1×工作液。
酶結(jié)合物工作液：按當(dāng)次檢測(cè)所需用量，于使用前20分鐘，用酶結(jié)合物稀釋液將濃縮酶結(jié)合物稀釋成1×工作液。
實(shí)驗(yàn)操作
1. 從已平衡至室溫的密封袋中取出試驗(yàn)所需板條，未用的板條和干燥劑請(qǐng)放回鋁箔袋內(nèi)壓實(shí)自封條，密封口袋，放回4 °C。
2. 空白孔加標(biāo)準(zhǔn)品&標(biāo)本通用稀釋液，其余相應(yīng)孔中加標(biāo)本或不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品(100 ul/孔)，用封板膠紙封住反應(yīng)孔，37 °C恒溫箱，避光孵育90分鐘。
3. 提前20分鐘準(zhǔn)備生物素化抗體工作液。
4. 洗板5次。
5. 空白孔加生物素化抗體稀釋液，其余孔加入生物素化抗體工作液(100 ul/孔)。用新封板膠紙封住反應(yīng)孔，37 °C恒溫箱，避光孵育60分鐘。
6. 提前20分鐘準(zhǔn)備酶結(jié)合物工作液。避光室溫(22-25 °C)放置。
7. 洗板5次。
8. 空白孔加酶結(jié)合物稀釋液，其余孔加入酶結(jié)合物工作液(100 ul/孔)。用新封板膠紙封住反應(yīng)孔，37 °C恒溫箱，避光孵育30分鐘。
9. 打開酶標(biāo)儀電源，預(yù)熱儀器，設(shè)置好檢測(cè)程序。
10. 洗板5次。
11. 加入顯色底物(TMB)100 ul/孔，37 °C恒溫箱，避光孵育15-30分鐘，通?？筛鶕?jù)孔內(nèi)的反應(yīng)顏色來判定何時(shí)終止反應(yīng)，一般標(biāo)曲的孔呈明顯梯度時(shí)即可終止。
12. 加入反應(yīng)終止液100 ul/孔, 混勻后即刻測(cè)量OD450值(3分鐘內(nèi))。
13. 在儀器保存讀數(shù)結(jié)果。實(shí)驗(yàn)完畢后將未用完的試劑按規(guī)定的保存溫度放回電冰箱保存至有效期結(jié)束。
具體產(chǎn)品實(shí)驗(yàn)步驟可能存在差異，請(qǐng)以實(shí)際說明書中的操作步驟為準(zhǔn)。
建議保存酶標(biāo)板框，以備下次或者今后試驗(yàn)使用。
數(shù)據(jù)處理
讀取并保存數(shù)據(jù)后，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度作橫坐標(biāo)，OD值作縱坐標(biāo)，使用軟件繪制并選取最佳擬合曲線，推薦使用二次多項(xiàng)式方程擬合。通過標(biāo)本的OD值可在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出其濃度。
若標(biāo)本OD值高于標(biāo)準(zhǔn)曲線上限，應(yīng)適當(dāng)稀釋后重測(cè)，計(jì)算濃度時(shí)應(yīng)乘以稀釋倍數(shù)。
關(guān)于數(shù)據(jù)處理的詳細(xì)建議，請(qǐng)點(diǎn)擊查看我們網(wǎng)站的文章內(nèi)容“ELISA數(shù)據(jù)處理”。
