ELISA素來以靈敏度較高、特異性較好的特點在臨床上得到了廣泛的應(yīng)用。而它作為經(jīng)典的免疫檢測方法，雖然看似平常但是要真正將該實驗做好并不容易，酶標(biāo)板的讀值總是會不盡如人意，可見實操中的各個環(huán)節(jié)對該實驗的檢測效果影響較大，如不注意，就會產(chǎn)生一些糟心的實驗結(jié)果。
問題1：低信號強度
如果ELISA讀數(shù)低于吸光度下限（<000），且目標(biāo)樣本濃度超出標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍，則進(jìn)行分析的樣本濃度可能太低，或者儀器所能分析的樣本檢測最佳條件可能未被滿足。在這種情況下，樣本所產(chǎn)生的檢測信號應(yīng)該需要被級聯(lián)放大。
解決方案：
1.增加抗體的孵育時間。如果依照protocol在室溫下孵育您的抗體2小時后的實驗結(jié)果并不理想，那么可以嘗試在4°C孵育過夜。如此，可允許抗原抗體最大程度上的結(jié)合，并能擴大ELISA中的反應(yīng)信號。
2.增加二抗-酶結(jié)合物的濃度。ELISA中的E代表酶（通常是辣根過氧化物酶，HRP），它與底物（通常是TMB）反應(yīng)后可產(chǎn)生鮮艷的藍(lán)色。因而，將HRP濃度提高50％或?qū)⑵浼颖叮瑒t會產(chǎn)生更強的顏色，易于檢測。
3.充分避光，以保護(hù)TMB基質(zhì)不受光照影響，并確保其能最大限度地發(fā)揮其性能?？紤]到TMB對光線非常敏感，因而在黑暗中進(jìn)行ELISA平板的顯色反應(yīng)會產(chǎn)生更強的信號。
問題2：高背景
ELISA板上的空白孔通常被用作為陰性對照，當(dāng)該組中任意孔的讀數(shù)明顯大于0，這均表示實驗背景有問題。
解決方案：
1.室溫過高，可能會導(dǎo)致實驗結(jié)果偏高。因而，如果發(fā)現(xiàn)所有的實驗孔的讀數(shù)均偏高，請注意控制恒溫箱溫度，盡可能將其穩(wěn)定在37℃左右。
2.平板孔內(nèi)因清洗不徹底，而導(dǎo)致有酶或底物殘留，同樣會產(chǎn)生高背景。此時需要按照protocol對ELISA平板進(jìn)行清洗，可不任意減少洗板液的體積以及洗板次數(shù)，同時也需要按要求操作，并適當(dāng)延長清洗液浸泡孔的時間。
3.加樣或加酶時導(dǎo)致了陰性孔的污染。此時需要及時更換吸頭以避免造成污染，切忌僥幸心理。
4.試劑過期或被污染。實驗操作過程中不要使用過期試劑，并防止組分污染。如使用容器時，應(yīng)注意容器的清潔。
問題3：重復(fù)性不好
同一個樣本間的各個復(fù)孔的讀數(shù)有顯著性差異。
解決方案：
1.加樣量多少不一，操作時間長短不一。重復(fù)同一樣本時，加樣量與加樣時間理應(yīng)相同，同時也應(yīng)注意移液器的校準(zhǔn)。加樣后可輕微晃動酶標(biāo)板使反應(yīng)液充分混合。
2.樣本應(yīng)保證一致、無污染，并應(yīng)該由同一名操作人員進(jìn)行操作。
3.精密度測定方法不標(biāo)準(zhǔn)，此時理應(yīng)采用正確的方法進(jìn)行操作。
問題4：干擾
干擾物質(zhì)如清洗劑或NADH（存在于血清中）可能會影響ELISA平板的吸光度讀數(shù)并使得實驗結(jié)果偏離真實結(jié)果。
解決方案：
1.嚴(yán)格按照protocol進(jìn)行實驗操作。通常protocol中會指出會對實驗產(chǎn)生干擾的化學(xué)物質(zhì)，以及會告知實驗者如何避免它們。比如在進(jìn)行血紅蛋白干擾的血清測定中，通常會建議不要使用溶血的血清樣品。
2.有時可能你也別無選擇，只能使用含有干擾物質(zhì)的樣品。如果你感興趣的抗原濃度較高，可以使用一個濃度較低但仍易于檢測的樣品稀釋液，如此可以稀釋樣本中的干擾物質(zhì)并降低其對實驗的干擾。
問題5：陽性與陰性不能達(dá)到2.1的比值
陰性顏色太深，又或者陽性顏色太淺。
解決方案：
1.當(dāng)陰性顏色太深時，則陰性對照（也就是陽性對照的除目標(biāo)抗原外的其它成分）中可能有某種成分與一抗作用。此時可通過純化抗原除去干擾成分。
2.當(dāng)陽性顏色太淺時，原因可能有3個：一抗效價不好，換用一抗或增加一抗用量；抗原太稀，增加抗原濃度；封閉時間過長，應(yīng)縮短封閉時間，封閉時間一般37攝氏度2個小時，或者4攝氏度過夜。
問題6：增加抗原濃度，一抗?jié)舛炔蛔?，顯色反應(yīng)沒有表現(xiàn)出應(yīng)有的梯度
一抗與抗原的比例已經(jīng)飽和。
解決方案：
增加一抗用量; 或在一抗用量不變的情況下減少抗原濃度做梯度。
問題7：增加一抗?jié)舛?，抗原濃度不變，顯色反應(yīng)沒有表現(xiàn)出應(yīng)有的梯度
一抗與抗原的比例已經(jīng)飽和。
解決方案：
增加抗原用量；或在抗原用量不變的情況下減少一抗?jié)舛茸鎏荻取?/p>
問題8：加完TMB顯色后顏色梯度很明顯，但加了硫酸終止反應(yīng)后顏色梯度沒有那么明顯了？
硫酸可能把其它成分都炭化了
解決方案：
加少一點硫酸，參考值：50 μlTMB+35 μl硫酸；或者采用1M的HCL作為終止液，50ulTMB+50ul1M HCL。
其它ELISA問題見：常見問題
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