作為整個(gè)ELISA實(shí)驗(yàn)的最后一步,檢測結(jié)果的計(jì)算對于整個(gè)實(shí)驗(yàn)十分重要。
以夾心法ELISA的數(shù)據(jù)處理為例。
1.ELISA的樣本通常要設(shè)置1~2個(gè)復(fù)孔進(jìn)行檢測,這樣才能為結(jié)果的統(tǒng)計(jì)驗(yàn)證提供足夠的數(shù)據(jù)。分別求出標(biāo)準(zhǔn)品、實(shí)驗(yàn)組樣本的吸光度的平均值。復(fù)孔檢測結(jié)果的變異系數(shù)(CV)不應(yīng)超出20%。
2.建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品和樣本的OD值(吸光度)平均值要減去標(biāo)準(zhǔn)品濃度為0時(shí)的OD平均值,以標(biāo)準(zhǔn)品濃度作橫坐標(biāo)、OD值作縱坐標(biāo),擬合曲線。
通常酶標(biāo)儀會(huì)配置相應(yīng)數(shù)據(jù)處理軟件,具有豐富的曲線擬合選項(xiàng)。如條件不具備,標(biāo)曲的建立建議使用相關(guān)計(jì)算機(jī)程序來完成,如GraphPad Prism、Origin、Excel等。
下圖展示了一條具有代表性的標(biāo)準(zhǔn)曲線,數(shù)據(jù)來自QuantiCyto? Human IFN-γ ELISA(EHC102g.96.)。
注:本圖僅供參考,應(yīng)以同次試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)品所繪標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算標(biāo)本中人IFN-γ的含量。
3.根據(jù)擬合的標(biāo)準(zhǔn)曲線,通過待測樣品的OD值計(jì)算出樣本的濃度。若樣品經(jīng)過稀釋,須乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)。
4.對于OD值落在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍外的樣品,為獲得準(zhǔn)確的結(jié)果,需排查可能存在的問題。
(1)待測樣品的OD值低于標(biāo)準(zhǔn)曲線的最低值,建議設(shè)置陽性對照孔來排查,用明確表達(dá)的樣品作為陽性對照,如果標(biāo)準(zhǔn)曲線及陽性樣品均可測得正常的表達(dá)濃度,則表明實(shí)驗(yàn)成功,??蛇M(jìn)一步排除其他原因,比如待測樣品是否稀釋倍數(shù)過高,這樣可以通過降低稀釋倍數(shù)進(jìn)行改善。如果使用原液檢測還檢測不出,則表明該指標(biāo)在其余待測樣品中表達(dá)含量低于試劑盒的檢測靈敏度。這種情況對于正常血清/血漿樣本中的炎癥因子較為常見。
(2)待測樣品的OD值高于標(biāo)準(zhǔn)曲線的最高值,應(yīng)適當(dāng)稀釋后重新檢測,計(jì)算濃度時(shí)應(yīng)乘以稀釋倍數(shù)。
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